2.3.4　YH5和TH2菌群结构的分析

经过对YH1到YH6油井采出液和TH1到TH6含油污泥400d的富集培养，主要测定了气体含量及种类，尤其对甲烷产气量进行了计算，得知YH5和TH2菌群的产甲烷量最高。对YH5和TH2菌群的石油降解率、石油烃的利用情况进行了细致分析，得出：YH5和TH2是高效厌氧降解石油烃产甲烷菌群，而文后彩图2是石油培养前后的照片，从照片中可以看到，石油经过长达400d的厌氧培养产气后，在厌氧瓶中会有大量的沉淀产生，溶液变浑浊并且呈棕黑色，液面上的原油被降解分散。下面将对YH5和TH2中的细菌群落结构进行分析，以求阐明其细菌群落结构；另外，本章研究的菌群是当有稳定甲烷气体产生后培养瓶中的菌群。

前面测定了400d后它们厌氧瓶内顶部空气的甲烷含量，并且做了细致研究。下面进一步对这两种菌群的DNA进行提取。

首先对杂质进行沉淀过滤，然后用微量移液枪吸取上清液，重复多次操作，离心后对菌体DNA进行提取，加入玻璃珠，然后加入磷酸盐缓冲液（120mmol/L磷酸盐缓冲液，pH值为8.0）、0.5mol/L Tris HCl （pH值为8.0）、0.1mol/L NaCl和10% SDS，在破壁仪上进行破壁，时间为30s。然后用 Tirs 饱和酚、酚异戊醇氯仿（25∶1∶24，pH≥7.8）、异戊醇氯仿（1∶24）进行抽提。所得DNA通过Promega 试剂盒进行纯化后^[40]，然后进行PCR。如文后彩图3所示，可知DNA亮度非常明显，只是含有一些拖尾，可能是提DNA的时候有碎片。然后用提取的DNA进行PCR-DGGE分析菌群结构组成。

而PCR-DGGE技术（基于聚合酶链式反应的变性梯度凝胶电泳技术）已经被广泛地应用（图2-14），特别在石油污染修复、高效石油烃降解菌的筛选、石油的开采等科研领域均大量使用，而且该技术也被用来分析油藏中微生物群落结构^{[36～45，86，87]}。该技术可以快速了解某地区的生物结构和组成，为石油污染修复、高效石油烃降解菌的筛选、石油的开采等提供理论基础，可以针对特殊菌群采取相应的办法。而该技术应用在石油烃厌氧产气时同样有巨大的潜力。为了对石油烃厌氧产气的微生物组成有一个宏观的了解，我们特地使用了PCR-DGGE技术，而在变形梯度凝胶电泳（DGGE）中，为了使每种菌的DNA片段更好的分散，从而加以区分，所以需要较短的DNA片段，通常在500bp以下，因此在厌氧降解石油烃产气过程中选用了引物341F-GC和534R（见表2-7），GC夹的目的就是防止双链完全解开，更好地使DNA扩增片段在相应的变性剂浓度上停止，达到分离的目的^[71～75]。

PCR扩增包括变性、退火和延伸3个反应阶段，各阶段的原理及条件如下。

（1）变性

简单来说是指在94℃的条件下模板DNA或PCR扩增后的双链解旋，变成两条单链，这种解旋是可逆的，当温度改变又会变成双螺旋结构，为下一步的进行提供准备。

（2）退火

退火即复性，在55℃时，解链的DNA模版与相应的引物配对，在DNA聚合酶的作用下开始形成一条完整的DNA的过程，就是说体系中投加的引物与变性后形成的DNA单链上的序列互补结合。

（3）延伸

退火阶段后，在引物72℃时，引物已经与DNA单链结合，在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，以DNA单链为模板母链，合成母链加子链的双链的过程，即通常说的半保留复制，从而实现扩增^{[38～43，71～76, 88～94]}。

经过多次重复试验，确定了本章试验中的最佳PCR反应条件：94℃预变性5min, 94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。从文后彩图4中可以发现，其为YH5和TH2菌群DNA被提取后，通过对细菌基因组（包括古细菌）中的16S rDNA V3区的保守序列进行PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图像，电压为95V，时间30min，通过EB染色15min后，用成像系统对其拍照^{[41～45，71～76]}。最左侧是Marker标准的DNA片段图像，其长度从下至上分别为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp和1500bp，扩增后产物的长度为200bp左右，说明其为目的片段；同时非特异扩增不明显，片段较纯，条件合适，而且，在阴性扩增中，只有引物二聚体，没有发现其他扩增条带，说明该PCR过程并未受到污染，扩增结果可信。而有学者研究表明：如果要消除非特异性扩增条带的现象，可以通过以下几种方法。

① 引物的种类更换或者调整引物量的多少。

② 调整混合体系的量。

③ 适当增加DNA模板量，减少循环次数。

④ 提高退火温度。

而本研究中的PCR产物是通过纯化试剂盒的多次提纯，以切胶回收的方式将非特异性条带去掉。回收的PCR产物重新作为模板DNA用相同的引物进行PCR扩增^[72，74]。

本章通过DGGE技术比较了YH5和TH2中的菌群结构的异同，通过文后彩图5的YH5和TH2的细菌DGGE结构图可以得出：经过对采出液和含油污泥长时间连续的富集培养，YH5和TH2都有较丰富的细菌DNA条带，而且通过右侧的泳道分析表明：YH5大约有12条明显的条带，而TH2大约有7条明显的条带，这些条带形状粗细均匀，颜色明亮，分开的恰到好处，可以在下一步分析中使用。

前面研究产甲烷的时候，在第400天时YH5菌群和TH2菌群产生的甲烷最多，每天会有1.5μmol的甲烷产生，这时的YH5和TH2是在众多培养来源中产甲烷最多的两个菌群，所以要对这两个样品进行细致的分析。

而通过文后彩图6的YH5和TH2的古细菌DGGE结构可以得出：经过对采出液和含油污泥长时间连续的富集培养，古细菌条带会较细菌条带明显偏少，YH5和TH2都有相应的古细菌DNA条带，而且通过泳道分析表明：YH5大约有6条明显的条带，而TH2大约也有6条明显的条带，这些条带形状粗细均匀，颜色明亮，分开得恰到好处，可以在下一步分析中使用。有研究表明：产甲烷古菌广泛存在于土壤、底泥、地热环境、油井、海底沉积物中^[95]。同时厌氧产甲烷古菌处在有机物降解产甲烷的最后环节，通过利用小分子物质产甲烷，而甲烷气体有着广泛的应用^[96，97]。产甲烷古菌分为3种营养类型，分别是氢营养型、甲基营养型、乙酸营养型，并且通过其他菌群的协同作用将长链有机物降解成短链的无机物或有机物，然后产甲烷古菌再降解产生甲烷^[98，99]。

具体的3种类型都包括以下菌群。

① 氢营养型，主要有伊万诺夫甲烷杆菌^[100]、热自养甲烷杆菌^[101]、布氏甲烷杆菌和嗜热嗜碱甲烷杆菌^[102]、热自养甲烷球菌^[103]、石油甲烷盘菌属^[104]、耐盐甲烷卵圆形菌^[105]。

② 甲基营养型，主要有盐水甲烷嗜盐菌^[106，107]、斯氏甲烷八叠球菌^[108，109]等。

③ 乙酸营养型，主要有马氏八叠球菌^[110]等。

对DGGE优势菌群条带进行研究，从而鉴定出可能的细菌种类或最相似种类，所以对DGGE片段进行切胶回收，在DGGE电泳结束后，用事先准备好的经过高温高压灭菌的小刀，在紫外灯照射下（图2-15）对聚丙烯酰胺凝胶照相并切胶回收。切胶时佩戴护目镜，对优势条带进行切割，然后用灭菌牙签迅速将切割后的条带转入放在冰上已经灭菌的离心管中。因为紫外线会破坏DNA结构，所以切胶的动作一定要快，并且离心管要放到冰上，然后在离心管中加入无菌水并且漫过胶块，对离心管进行密封保存，并于4℃冰箱中过夜。胶块中的DNA片段浓度较高，会自动进入到无菌水中，因为DNA会自动降解，所以在4℃冰箱中不能保存过久^[72，74]。

为能够得到足够的DNA样本容量，而且在测序的时候不能有GC夹，所以需要对回收的DNA进行二次PCR，二次PCR的引物需要与第一次相同，只是不带GC夹。反应体系选取20μL，DNA模版的量为0.5μL进行PCR试验，通过实验验证二次PCR扩增条件跟一次PCR条件相同时效果最好，选用PCR最佳条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。经过回收的DNA送上海生工生物进行测序 ^{[38，72，74]}。经过测序，然后在国际权威数据库GenBank中进行序列分析比对^[72，74]，通过序列比对就能知道分析对象的可能的细菌群落结构，如图2-16所示为NCBI数据库中YH5和TH2部分相似序列比较。

进一步研究分析表明：如表2-15所列，可以看到最相似序列的名称、相似度、Genbank编号，从而对YH5和TH2的细菌群落结构有了初步分析，其中，最相似细菌为严格厌氧的而且是耐高温的石油烃降解菌，具有降解石油的能力，可以产生氢气、二氧化碳、乙酸、丙酸等小分子有机物^{[41，111，112]}，而在最相似的古菌里都是嗜热严格厌氧的产甲烷古菌，能利用氢气、二氧化碳、小分子有机酸产生甲烷，其中有甲基营养型、氢营养型等，这些古菌与已知的从胜利油田分离的产甲烷古菌有高度同源性，特别要强调的是这些古菌中含有与甲烷八叠球菌相似的菌株^[93，113]。综上所述，具体的降解石油烃产甲烷菌群还需要在以后章节进行细致的分析研究。