上QQ阅读APP看书，第一时间看更新
第四节 心血管系统的毒性评价
一、心血管毒性临床前评价的相关指导原则
对于心血管毒性的试验研究，目前有ICH和EMA等权威机构颁布的指导原则给出了框架式的建议。其中ICH S4指南“动物(啮齿类和非啮齿类)慢性毒性试验的期限指导原则”和EMA“重复给药毒性指南”建议在两个哺乳动物种属中对心血管毒性进行研究，包括啮齿类和非啮齿类动物种属。与心血管毒性相关的重复给药毒性检测指标包括心脏的组织病理学检查及在非啮齿类动物中进行的心电图测定。
ICH S7A指南的颁布旨在发现某物质可能与人体临床安全性有关的不期望出现的药效学特性，评价毒理试验和(或)临床研究中观察到的某物质的不良反应和(或)病理生理作用，研究所观察到的和(或)可疑的不良作用机制。该指南建议对三大核心组合试验进行研究，其中对于心血管系统，可对功能性检测指标如血压、心率、心电图参数、复极化和传导异常、心输出、心室收缩及血管阻力等进行评价。
ICH S7B人用药物潜在致心室复极化延迟作用( Q-T间期延长)的非临床安全性评价指南涉及评价受试物延迟心室复极化潜能的非临床试验策略。目前认为药物诱导的人快速延迟性整流性钾通道基因( hERG，编码负责I Kr电流的成孔蛋白)阻断和Q-T间期延长可作为TdP(尖端扭转型室性心动过速)发生的预测指标。图5-1为Q-T和TdP示意图，VF为心室纤颤波。该指南基于体内和体外心电图研究推荐了一个非临床试验研究策略，其中体外试验评价药物对 hERG通道或I Kr的影响，追加研究要求在组织水平上进行评价;非啮齿类动物(猴和犬)体内试验推荐使用清醒遥测动物，以评价心电图参数如Q-T间期、血压、心率、P-R间期、QRS间期。
图5-1 Q-T和TdP示意图
与心血管毒性相关的指南详见表5-5。
表5-5 与心血管毒性相关的指南
二、体内外评价模型
心血管毒理学研究方法传统上可分成两大类，即体外试验和体内试验，一般以体内为主，但目前人们越来越多地利用体外试验来进行毒理学检测和评价。除了常规毒理学本身的技术和方法，比如实验动物的组织病理解剖、血清生化学、血液学、骨髓细胞分类计数、脏器重量及脏器系数等;此外，随着心血管药理学、电生理学、心功能学、生物化学、免疫学、细胞生物学、分子生物学、流行病学、医学影像学、流式细胞术技术以及磁共振技术等大量新技术和新方法的应用，使心血管毒理学研究水平更加深入;同时，体外细胞检测和转基因动物或基因敲除动物模型在毒理学研究中的广泛应用，也为心血管毒理学研究提供了重要的试验替代方法以及试验模型。可以说上述各学科的研究成果及技术方法都可以利用来研究心血管药物或毒物对心血管系统所造成的影响，唯一应该注意的是，在进行评价时，应根据药物或毒物的先期研究特点及相关资料的积累来设计试验，且应秉承“具体问题具体分析( case by case)”的原则，尤其是对于创新性药物更应如此。
选择并使用恰当的试验模型是心血管毒理学研究的关键之一。目前，在心血管毒理学研究中经常用到的试验模型有以下几种:
(一)心血管毒理学研究中常用的实验动物模型 1.常规毒理学研究中使用的动物模型
常规研究动物一般包括啮齿类及非啮齿类动物如:大鼠、小鼠、犬、灵长类、家兔等。选择实验动物应根据其对药物的敏感程度或者依据药物在该种属动物体内的代谢转归与人体内代谢过程具有相似性;在目前国内的条件下，所选择的动物应方便易得且价格合理。
2.与临床相关的心血管疾病动物模型
根据试验需要我们可以利用各种方法在相关种属动物身上制造出与人类临床心血管疾病相类似的病理模型，以研究心血管毒物对特定病理改变的影响以及可能的毒性作用机制。可以借鉴心血管药理学中所用造模技术及方法。
3.转基因动物模型
近年来人们运用基因敲除( gene knockout)技术以及转基因技术建立了许多基因动物模型，以用于探讨敲除基因或转入基因对心血管的影响。如使用基因敲除方法建立缺乏低密度脂蛋白的小鼠模型来研究其在高胆固醇脂血症中的作用。针对心力衰竭时β肾上腺素受体下调，降低心肌收缩力，用EB病毒质粒载体携带β肾上腺素受体基因，直接注入仓鼠衰竭的心室肌内，2～3天后每搏输出量显著增加，对异丙肾上腺素的强心作用也明显增强。
(二)人工体外筛选的细胞(系)模型
随着各学科试验技术水平的发展，有越来越多的体外试验用于毒理学检测和评价。在心血管毒理学研究中，试验目的不同，则体外试验选用不同的细胞(系)模型，一般进行研究所选用的细胞(系)模型包括:大鼠、小鼠心肌细胞原代培养、血管内皮细胞培养及损伤模型、血管平滑肌细胞培养等。
(三)离体灌注心脏研究模型
离体灌注心脏模型常用于研究毒物对心脏的作用，包括毒物对心脏收缩强度和速率及冠脉血液流速等的影响。
三、化学药物心血管系统评价的技术及方法
(一)用于评价的细胞来源
在心血管毒理学研究中常用的离子通道细胞的获得，一般有两个途径，一种是在非心肌细胞系细胞上表达人类离子通道蛋白的异源性表达系统和消化分散处理的心肌细胞，另外一种是对哺乳动物细胞的原代培养(通常使用豚鼠、家兔、犬、猪和雪貂)。一般来说，在每个表达系统中仅有一种异源离子通道类型，因此无法对多离子通道的影响进行检测。例如，维拉帕米作为阳性药物可以在异源表达 hERG的中国仓鼠卵巢细胞( CHO)和人胚胎肾细胞( HEK)中检测到，但在原代培养的心肌细胞中检测为阴性。原代心肌细胞可以组装成各种心肌离子通道。某些化合物的多通道作用将不会导致假阳性或假阴性结果。但是由于使用手动膜片钳技术，可能导致高成本和低通量。
此外，适合的组织或细胞标本对于一个测定的预测性尤为关键。因为不同的细胞类型和不同部位的细胞在不同离子通道的分布上均存在差异。人胚胎干细胞来源的心肌细胞有可能提供人源化心肌细胞，有助于克服种属差异所带来的问题。但是人胚胎干细胞来源的心肌细胞也有其局限之处，不同的检测指标导致细胞类型的变化，一般来说心肌细胞的变化率在60%至80%之间，并且常常混合其他类型的细胞，如成纤维细胞。细胞的发育阶段对于一个测定的预测性也具有至关重要的影响，原因在于胚胎期和成熟期心肌细胞中细胞蛋白的表达不同，因此成熟心肌细胞更适用于成年人心脏毒性方面的检测。
(二)体内外血压检测方法
心血管中对血压的测定往往是最主要考虑的测定项目之一。一般主要监测动脉血压，动脉血压的形成与五个因素有关:即心排出量、血容量、周围血管阻力、血液黏稠度和动脉壁弹性。收缩压决定于心肌收缩力和心排出量，且变化较大，舒张压决定于周围血管阻力，较为恒定。舒张压还间接提示冠状血管血液灌注量和心血管系统的负荷。动脉压的高低虽然与组织灌注是否良好并不完全一致，但监测动脉压是评定循环功能必不可少的重要手段，是体外循环手术中一个重要的参数。
测定动物血压的方法很多，按测定方式主要可分为直接测定和间接测定两种。其中，间接测定是利用外部压迫装置使血流阻塞来进行，主要应用在灵长类、人类的四肢端以及犬和大鼠的尾部;而直接测定则是通过对动物进行手术后再进行测定。常用的动物有犬、猫、家兔和大白鼠。在表5-6中列出了各种动物的常用血压测定方法及优缺点比较。
表5-6 实验动物常用测量血压方法比较
续表
(三)离体组织( isolated tissue)
离体组织通常从豚鼠、家兔和犬中获取，包括心室乳头肌、心室间隔、普肯耶纤维( Purkinje fiber)、左心室楔形标本，主要作为安全性药理学追加评价研究的一个部分。离体心肌组织检测优点在于可以检测到药物对全体细胞的影响。检测参数包括传导速率、动作电位的形状、空间分布(如药物对不同细胞层不同的影响)。
(四)离体器官( isolated organs)
Langendorff离体心脏是最常用的用于检测整体心脏功能特性的模型。该检测方法常用于候选化合物开发和安全性药理学追加评价研究。通常是逆行灌注心脏几小时监测候选药物对心脏的影响，能够鉴别出室上性和室性药物的影响。目前绝大多数离体心脏模型都是房室阻断模型。
(五)心脏切片标本( cardiac slice preparations)
心脏切片标本的主要优势在于空间特点被定位于几乎完整的组织中。将切片点到微电极阵列中，能够描测出局部激活时间、检测延迟及计算传导速率。根据所选用动物的种属及年龄，所制备的切片可以孵育几天到几周，以便监测药物的长期作用。目前认为，心脏的心外膜、中间的心肌层、心内膜对于能够诱发Q-T间期延长的药物的敏感性不同，这些差异对于早期去极化的产生具有极大的作用。
(六)计算机模拟方法( in silico methods)
“ in silico”是生物信息学的新名词，字面解释是“硅片上的研究”，是相对应于 in vivo(在体内)与 in vitro(在体外)而产生的新名词，它强调使用电脑来解决生物学上的问题，主要是通过定量结构活性关系的计算机模型或专家系统预测化合物的毒性。目前在致癌性、致突变性的计算机定量构效关系研究方面已取得较大进展。在心血管技术研究上，该方法常用于预测化合物同时作用于几个靶标所产生的网络效应。例如对于具有较高选择性的小分子离子通道阻断剂，其所致的网络效应常规方法极难预测，但可将待开发阻断剂在研发早期放在心肌细胞“ in silico”模型中进行模拟和预测。如果模拟结果显示与当前已知能导致动作电位时程( APD)延长或致心律失常作用的化合物体外和体内数据相关，则可以提前将之剔除，以避免不必要的动物使用。用于模拟心脏毒性的“ in silico”需要使用复杂的模型来模拟离子通道阻断剂诱导心肌细胞复极化、不应性和传导性等所产生的变化。具体作用大小还因种属和所选模型(如犬、家兔和人)的不同而有所差异，且所选模型的预测性还与加入模型的数据种类、数量如离子通道类型、密度、动力学、三维结构等密切相关。
(七)结合测定( binding assays)
在药物早期开发中的一个典型步骤是将理论上亲和性研究转化为结合测定试验。在该试验中，检测受体或通道与放射标记的配体受试化合物的结合能力。该方法并非是功能性检测方法，且难于模拟电压依赖性阻断剂，另外，上述方法由于仅基于特异的结合区域，因此常用于非人体靶标样本(如大鼠细胞膜样本)。
(八)功能流量测定( functional flux assay)
与结合测定相反，功能流量测定主要应用于药物开发，尤其在人体上监测通过特殊离子通道的实际离子流量。如在 hERG通道中使用铷流量测定。该检测方法使用铷负载的细胞，用药物孵育，暴露在电压改变通道下，该通道可根据细胞外钾离子增加而开放，在此体系中铷离子流可在细胞外上清液中检测到。此外，基于荧光技术的检测方法如自动荧光成像板读卡器( fluorometric imaging plate reader，FLIPR)也可用于离子通道功能性监测。
(九)自动和手动膜片钳( automated and manual patch clamp)
自动和手动膜片钳检测被认为是在心脏安全性药理学电生理评价中的“金标准”，并被ICH S7B推荐使用于离子通道评价中。该技术可以应用到各种各样的细胞，如兴奋细胞的研究，特别是有用的神经细胞、心肌细胞、肌纤维和胰腺β细胞。目前，主要使用CHO和HEK进行安全性药理学研究。
电压和配体门控式离子通道常使用手动膜片钳进行研究。虽然传统的膜片钳方法能提供高信息内容，但劳动力密集、低通量和高成本限制了该方法的广泛应用，因此，自动膜片钳技术发展用于提高通量并降低每个数据点的费用。另外，目前还有许多技术在开发中，如以微芯片为基础的膜片钳系统，还有FLIPR ®系统的应用，它们可实现更高程度的小型化、更快的灌注和混合，并降低成本。
(十)微电极阵列技术( microelectrode array technique)
微电极阵列技术在广义上涉及计算机科学、工程学或者远程通信技术等，泛指那些以杂交为基础的，用以DNA或者其他生物组分构成的阵列进行基因表达、基因分型、作图、测序等研究的试验技术。此处微电极阵列技术则是允许非侵入性电生理信号从电活体心脏组织通过场电位，要求场电位首先是由负相动作电位衍生，并用于复极化延迟( Q-T间期延长)和相关参数分析。心肌细胞跳动频率通过微电极阵列电极电刺激以获得不需进行频率校正的场电位。微电极阵列技术尤其适用于记录来自新生或胚胎哺乳动物及禽类种属干细胞来源的心肌细胞(鼠类、灵长类和人)和心脏切片组织。
(十一)致心律失常模型( proarrhythmia models)
致心律失常模型的研究，目的在于发现药物诱发心律失常的风险，以及诱发Q-T间期延长的可能。通常使用的体外模型包括分离的动脉灌注左心室楔形标本和Langendorff灌注家兔心脏模型等。最常用的体内模型包括甲氧明敏感家兔模型和慢性房室阻断犬模型等。这些模型中涉及分析的参数有延长动作电位的形状、逐次心搏复极化变异性、反向频率依赖、去极化启动后早期及复极化分散等。上述模型于近几年开发出来，对于尖端扭转型室性心动过速( TdP)产生的病原学提供了很重要的依据。同时，上述模型的系统性应用有助于对多种药物进行风险评价，能够理解Q-T间期延长也许并不是最佳的致心律失常预测标志物，而如Q-T beat by beat(逐次心搏的Q-T)变异性则可能更具有预测性。
(十二)心血管功能测定( cardiovascular function testing) 1.心血管功能测定
在心血管研究中常使用血流速测定技术来探讨血管中的血流速度。这种技术可用来对引起血管阻力改变的介入或心血管毒物进行评价。流速测定的方法灵敏且多样。常用的有:
( 1)直接费氏技术( direct Fick technique) :
该技术是最早用于测定心排出量的技术之一，主要是基于对单个个体氧消耗量及动静脉血中的含氧量的精细测定来进行测量。应用该技术时常使用吲哚菁绿( indocyanine green)来测定心排出量。
( 2)指示剂稀释法( indicator dilution) :
该技术是将一种染料或放射性核素溶液注入心脏附近的静脉血中，注入的指示剂经过数次心搏后即与血液混合，在浓度上发生差异。通过多次采取血液可测定在一个完全循环期内指示剂在血液中的平均浓度，该法可准确测定出心排出量。
( 3)电磁流速测定术( electromagnetic flowmetry) :
该技术通过将电磁流速测定电极植入血管管腔中来对血管内血流进行定量测定。
( 4)脉冲多普勒流速测定术( pulsed Doppler flowmetry) :
该技术系利用血流在超声波下运动所产生的多普勒漂移原理来测定血流速率。该技术优点在于可对在高心率下灌注时产生的变化进行评价，且所用探测电极比电磁流速测定技术中所用的价格低廉、尺寸变小。
( 5)渡越时间流速测定术( transit time flowmetry) :
该技术也是利用超声进行，其原理是使用广范围超声脉冲覆盖整个血管，同时测定血管内所有不同的流速。该技术可长期监控血流变化，血管直径在1mm到48mm范围内的都可使用该技术。
( 6)激光多普勒技术( laser Doppler) :
主要用于研究微血管灌注。优点在于无创、无损伤。激光扫描是该技术的改进，利用它可对毒物对皮肤循环的影响及所产生毒性的效能来进行评价。
( 7)微血管方法( microvascular method) :
该技术需要分别测定微血管尺寸及红细胞速率，在假设毛细血管呈圆柱状的前提下应用此两参数可计算出微血管中的血流速率。该方法优点在于无损伤，且可以提供微血管尺寸及流率的动态信息。
2.心脏功能测定 ( 1)心电图测定技术( electrocardiogram) :
在心肌舒张和收缩的同时，有微弱的电流产生，从心肌传导到周围组织，使体表各个部位在每一心动周期中发生电位的改变。应用心电图仪可在体表不同部位探测到这种电位的变化，变化反映了心房去极化( P波)、心室去极化( QRS波)及心室复极化( T波)过程。在心血管毒理学研究中，心电图是研究对心脏有选择性作用的毒物的重要测定指标之一。通过心电图检查可以反映心律失常、传导阻滞、心肌局部缺血等心肌疾病，并可阐明心肌损害程度及部位，判断某些急性中毒的疗效和预后;也可作为筛选解毒剂的有价值的观察指标。可用于心电图检查的常用动物包括大鼠、豚鼠、家兔、犬及猴等。不同种属的动物，心电图正常值有较大差异，对毒物作用的反应也有一定差异。
但是在上述条件下所测得的数据可能是在动物紧张情况下测定得到的，必然会对试验结果产生不可估量的影响。目前还有一种仪器可用于检测清醒、安静状态下动物的心电变化，即心电遥测系统( telemetry)。该系统将生理传感器和扩增器植入动物体内，所获得的信号则传送到接收器中，通过相应软件记录并进行分析。该系统可对一只或多只动物同时进行测定，该项技术目前在安全性药理学中被广泛应用。
( 2)超声心动图( ultrasound cardiography or echocardiography) :
该技术是应用超声回波原理检测心脏结构和功能的一种新型的非介入性心脏检查方法，目前已广泛应用于心血管疾病的检查和研究中。临床应用的超声诊断仪器包括: M型超声心动图( M-mode echocardiography)、二维超声心动图( two-dimensional echocardiography)、脉冲多普勒( pulse-wave Doppler)、连续多普勒( continuous-wave Doppler)及彩色多普勒( color Doppler)等类型。利用该项技术，可以直观显示心脏、大血管的结构和血流的动态变化，定量测定心排出量的血液流速，为无创检查心脏的分流和反流性疾病开辟了新的时代。
( 3)核医学检查:
心血管系统的核医学检查技术近几年来得到了迅速发展，并成为心血管疾病诊断与研究的重要方法之一，具有准确、灵敏、无创伤等特点，其检查范围包括:心功能检查、心肌显像、心肌断层显像、介入性核心脏病学、放射核素在先天性心脏病中的应用及体外试验等。
3.生物制品心血管系统评价的策略及方法
前面所涉及心血管系统评价的药物主要是小分子化学药物，但是对于生物制品如ICH S6中提及的细胞因子、纤溶酶原激活剂、重组血浆因子、生长因子、融合蛋白、酶类及单克隆抗体和ICH S6没有涵盖的SiRNA等的心血管系统评价则没有涉及。
根据ICH S7A的要求，对于具有高特异性受体靶点的生物制品，对于其安全性药理学评价指标往往作为长期毒性或毒代动力学的一个部分来进行，因此对于这些产品的单独安全性药理学研究可能被缩减或消除。对于一个全新的治疗分类和(或)没有高特异性受体靶点的产品，则需要对其进行更深入的研究评价。具体的评价策略包括以下几个方面:
( 1)生物制品尤其是单克隆抗体类，选择与其药理学活性相关的动物种属(可通过免疫组化确定相关种属)，在非啮齿类动物上进行重复给药毒性研究。在单次或多次给药及恢复期期间测定ECG和心率，确定是否对动物的心脏节律、传导、复极化及Q-T c间期延长有影响。重点对达血浆药物峰浓度的ECG参数进行采集，同时避免人为因素对动物产生的影响。可能的话尽量使用清醒无束缚设备如植入式遥测电生理采集系统或非植入式马甲遥测电生理采集系统等进行数据采集。
( 2)对于有可能对心血管系统有影响的生物制品，如单克隆抗体类，根据作用机制显示其靶标可能在心肌细胞或血管系统内(内皮细胞、血管平滑肌等)表达，则不仅需要进行血压、心率和ECG的测量，而且还需对单克隆抗体靶标抑制或激活所致心血管潜在影响进行评价。体内和体外方法均可以使用。
( 3)尽管化学药物要求对 hERG通道进行评价，但对于生物制品包括单克隆抗体类并不适合，因为生物制品往往对于特定靶标具有较高的选择性，且对 hERG通道的评价目前还只是列在对体内Q-T c机制研究的补充研究部分。
( 4)新出现的方法如生物信息学和途径定位等，有助于确定生物制品对于心血管系统的潜在风险。例如，计算机模拟交叉反应测定能够执行同源性搜索，将单克隆抗体抗原表位和 hERG通道外部核心区或其他离子通道进行序列排列。