核酸限制性内切酶（restriction endonuclease）是一类能够识别双链DNA分子上某段特定核苷酸序列，并在该序列中进行切割的核苷内切酶，主要存在于原核微生物中。而在宿主菌中可识别相同序列的DNA甲基化酶，只对本宿主DNA进行甲基化修饰，从而避免了内切酶对宿主DNA的作用，构成了原核微生物限制-修饰-保护机制的分子基础。

核酸限制性内切酶参与的反应均需要Mg ^2＋。表3-1和3-2显示限制性内切酶的类型及其特点。Ⅰ型限制性内切酶是大而复杂的蛋白质，由3种亚单位构成，既有限制性内切酶的作用，也有甲基化酶的作用，需要ATP（或dATP）和 S-腺苷- L-甲硫氨酸，它们识别两侧不对称DNA序列，并能随机在识别位点至少1000个碱基对处切除DNA，在其识别位点发生甲基化，例如EcoR和EcoK由3个不同亚基组成，识别位点为一个二重识别序列，甲基化位点与识别位点相同。Ⅲ型限制性内切酶在离识别序列3'端24～26个碱基对处切割DNA分子，如EcoPⅠ由两个亚基组成，识别序列不对称，酶切位点也不在识别位点上。如上所述，基于Ⅰ型和Ⅲ型限制性内切酶酶切位点与识别位点不同，且切割产物无特异性，因此在基因工程无应用价值。在基因工程操作中，主要采用的是Ⅱ型限制性内切酶（restriction endonucleaseⅡ），可特异识别和切割4～8个bp长度且具有回文序列的DNA片段，主要产生三种末端结构：5'-粘性末端，3'-粘性末端，平端。