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六、肽图分析
肽图分析对多肽结构研究和特性鉴别具有重要意义,它是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点,使用专一性较强的蛋白水解酶作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片段,通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱,是检测蛋白质一级结构中细微变化的最有效方法,也可以确证产品中二硫键的排列。同一品种不同批次的肽图一致性是验证工艺稳定性的重要指标,至少每半年测定一次。我国药典规定的法定方法是用胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法和溴化氢裂解法两种方法。肽图分析中对蛋白的纯度要求较高(纯度大于95%),蛋白浓度不低于1mg/m l且溶液中的盐离子浓度要小。
(一)胰蛋白酶裂解-反相HPLC法
胰蛋白酶裂解法使用方便、安全,非特异性降解少,结果可靠;但降解不完全,酶易失活,裂解后片段多及酶本身对测定结果有一定干扰。RP-HPLC法中小分子按疏水性大小分离,分辨率高、简单、重现性好,多用于重组蛋白的质量检定。它是以0.1%三氟乙酸水溶液及含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液为流动相,以流速为1ml/min,梯度洗脱70分钟(三氟乙酸水溶液从100%至30%),检测波长为214nm。将供试品溶液与对照品溶液图谱进行比较,即得。
(二)溴化氢裂解法
化学法简单,结果可靠,但有非特异性降解反应且所用试剂毒性强,安全性差。该方法是将供试品裂解、冷冻干燥,再进行SDS-PAGE电泳(胶浓度20%),银染法染色,并与对照品进行比较,即得。