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第四节 尿液有形成分检验
一、尿液有形成分分析仪
目前，在国内外已推出了能对部分尿液有形成分进行自动筛检分析的仪器，称尿液有形成分分析仪，这些系统多数采用电阻抗、光散射(包括对有形成分进行各种染色如荧光染色后的流式细胞术检测)或数字影像分析术的原理，识别或分类红细胞、白细胞、上皮细胞、小圆上皮细胞、管型、细菌、精子、黏液丝、结晶等有形成分，已逐步成为尿液显微镜检查的首选筛检方法。
【原理】 1.筛检方法一
采用流式细胞术和电阻抗法原理。先用荧光染料对尿中各类有形成分进行染色，然后经激光照射每一有形成分发出的荧光强度、散射光强度及电阻抗大小进行综合分析，得出红细胞、白细胞、上皮细胞、管型和细菌定量数据，以及各种有形成分的散射图和RBC、WBC直方图，尿中红、白细胞信息和病理性管型、小圆上皮细胞、结晶、酵母样细胞等信息。
2.筛检方法二
采用影像分析术和自动粒子识别系统原理。先用CCD数字摄像机自动捕获数百幅图像，然后进行数字化图像分析，用自动粒子识别软件进行比较，最后定量报告尿中多种有形成分的数量，包括红细胞、白细胞、白细胞聚集、透明管型、未分类管型、鳞状上皮细胞、非鳞状上皮细胞、细菌、酵母菌、结晶、黏液和精子等。
【试剂】
按仪器分析所需试剂的说明书准备试剂。
【操作】
各种仪器操作步骤不尽相同，操作前应首先仔细阅读仪器操作说明书。简单步骤如下:
1.准备标本
充分混匀收集的全部新鲜尿液，倒入洁净的试管中(标本量约10ml)。
2.启动仪器
打开仪器电源，待仪器动核查通过后，进入样本分析界面。
3.进行质控
如质控通过，则可继续下一步操作;如失控，则分析并解决原因后，才能继续患者标本检测。
4.检测标本
在仪器上输入样本号，按开始键手工进样，或由自动进样架自动进样。
5.复核结果
根据实验室设定的仪器分析结果复检规则(包括显微镜复核)，确认仪器分析结果。
6.发送报告
在确认仪器和复检结果的基础上，可发送检验结果报告。
【参考区间】
可供参考的全自动尿液有形成分分析仪分析结果的参考区间见表1-7-6。各实验室应根据仪器、试剂厂商所提供的参考区间和参考人群，通过必要的验证或评估来确定符合自身特点的参考区间。
表1-7-6 全自动尿液有形成分分析仪参考区间
【注意事项】 1.尿标本
自动化仪器检测常采用不离心新鲜尿液标本。
2.尿容器
应确保尿容器的洁净，避免存在任何污染物。
3.干扰结果的自身因素
尿中存在大量黏液、结晶、真菌、精子、影形红细胞等会使管型、红细胞、细菌等项目计数结果假性增高或减低。
二、尿液有形成分显微镜检查
(一)尿沉渣显微镜检查 1.试验方法 ( 1)尿沉渣未染色检查法 【器材】
1)离心试管:可用塑料或玻璃制成;须足够长，防止离心时尿液标本溢出;须干净、透明，便于尿液外观检查;须带体积刻度(精确到0.1ml) ;容积须＞12ml而＜15ml;试管底部应为锥形，便于浓缩沉渣;无化学物质污染;试管须有盖，可防止试管内液体溅出及气溶胶形成;建议使用一次性离心试管。
2)移液管:必须洁净;使用一次性移液管。
3)尿沉渣板:须标准化，具有可定量沉渣液的计数池，并一次性使用。如采用在普通玻片上滴加尿沉渣液后加盖玻片的检查方法，则不能提供标准化、可重复的结果。
4)显微镜:应使用内置光源的双筒显微镜;载物台能机械移动玻片;物镜能放大10倍、40倍，目镜能放大10倍;同一实验室使用多台显微镜，其物镜及目镜的放大倍数应一致。
5)离心机:应使用水平式有盖离心机;离心时须上盖，以确保安全。离心时的相对离心力应稳定在400g。应每12个月对离心机进行一次校正。
【操作】
1)尿标本用量:应准确取尿10ml。如标本量＜10ml，应在结果报告单中注明。
2)离心留尿量:在相对离心力400g条件下离心5分钟。离心后，一次性倾倒或吸弃上清尿液，留取离心管底部液体0.2ml。
3)尿沉渣制备:充分混匀尿沉渣液，取适量滴入尿沉渣板;或取20μl，滴入载玻片，加盖玻片( 18mm×18mm)后镜检。
4)结果报告:①方法1:以每微升(μl)单位体积各尿沉渣成分数量报告结果;②方法2:管型，以低倍( 10×10)镜视野全片至少20个视野所见的平均值报告;细胞，以高倍( 40×10)镜视野至少10个视野所见的最低～最高数的范围报告;尿结晶等，以每高倍镜视野所见数换算为半定量的“－、±、1 +、2 +、3 +”等级报告(表1-7-7)。
表1-7-7 尿结晶、细菌、真菌、寄生虫等报告方式
( 2)尿沉渣染色检查法:
有时，活体染色(如Sternheimer-Malbin染色或0.5%甲苯胺蓝染色)有助于细胞和管型的鉴别。但也不足以鉴别或确认尿沉渣中所有成分，如在检查下列有形成分时，可采用一种或多种特殊染色。
1)脂肪和卵圆脂肪小体:采用油红O染色和苏丹Ⅲ染色。
2)细菌:采用革兰染色和巴氏染色。
3)嗜酸性粒细胞:采用Hansel染色、瑞氏染色、吉姆萨染色、瑞-吉染色和巴氏染色。
4)含铁血黄素颗粒:采用普鲁士蓝染色。
通常，特殊染色需要制备特定涂片，如浓缩涂片、印片或细胞离心涂片。巴氏染色常用于肾小管上皮细胞、异常尿路上皮细胞、腺上皮细胞和鳞状上皮细胞的鉴别。Hansel染色用于检测嗜酸性粒细胞尿。
2.参考区间
因各实验室所用尿标本量、离心力、尿沉渣液量、观察尿沉渣用量、尿沉渣计数板规格等均不尽相同，尿沉渣检查参考区间应由实验室通过必要的验证或评估来确定。国外文献报道的参考区间见表1-7-8，国内《实用内科学》所提供参考区间与《希氏内科学》相同。
表1-7-8 国内外尿沉渣检查的参考区间
3.注意事项
实验室应统一尿液有形成分形态的鉴别标准和报告方式。
4.临床意义 ( 1)白细胞:
增多表示泌尿系统有化脓性炎症。
( 2)红细胞:
增多常见于肾小球肾炎、泌尿系结石、结核或恶性肿瘤。
( 3)透明管型:
可偶见于正常人清晨浓缩尿中;透明管型在轻度或暂时性肾或循环功能改变时可增多。
( 4)颗粒管型:
可见于肾实质性病变，如肾小球肾炎。
( 5)红细胞管型:
常见于急性肾小球肾炎等。
( 6)白细胞管型:
常见于急性肾盂肾炎等。
( 7)脂肪管型:
可见于慢性肾炎肾病型及类脂性肾病。
( 8)宽形管型:
可见于慢性肾衰竭，提示预后不良。
( 9)蜡样管型:
提示肾脏有长期而严重病变，见于慢性肾小球肾炎晚期和肾淀粉样变。
(二) 1小时尿沉渣计数
目前，12小时尿沉渣计数( Addis计数)因影响结果准确性的因素很多，故在临床上已很少应用。现常采用1小时尿沉渣计数。
【操作】
1.患者先排尿弃去，准确收集3小时尿液于清洁干燥容器内送检(如:标本留取时间5: 30～8: 30)。
2.准确测量3小时尿量，充分混合。取混匀尿液10ml，置刻度离心管中，15O0r/min离心5分钟，用吸管吸弃上层尿液9ml，留下1ml，充分混匀。吸取混匀尿液1滴，注入血细胞计数板内。细胞计数10个大方格，管型计数20个大方格。
【计算】
式中: 1000为μl换算成ml数; 10为尿液浓缩倍数。
【参考区间】
1.红细胞男性＜3万/小时，女性＜4万/小时。
2.白细胞男性＜7万/小时，女性＜14万/小时。
3.管型＜3400个/小时。
【注意事项】
1.尿液应新鲜检查，pH应在6以下，若为碱性尿，则血细胞和管型易溶解。
2.被检尿液比密最好在1.026以上，如小于1.016为低渗尿，细胞易破坏。
3.如尿中含多量磷酸盐时，应加入少量稀醋酸液，使其溶解;但切勿加酸过多，以免红细胞及管型溶解;含大量尿酸盐时，应加温使其溶解，以便观察。
【临床意义】
1.急性肾炎患者红细胞增加。
2.肾盂肾炎患者白细胞可明显增加。
(三)尿液有形成分检查的推荐参考方法
2003年，国际实验血液学学会( ISLH)提出了尿中有形成分计数的推荐参考方法，用于自动化尿液有形成分分析仪中红细胞、白细胞、透明管型和鳞状上皮细胞参考计数。
【试剂】 1.染色贮存液 ( 1) 2%阿辛蓝溶液:
阿辛蓝1mg溶解于50ml蒸馏水中。
( 2) 1.5%派洛宁B溶液:
派洛宁B 0.75mg溶解于50ml蒸馏水中。
溶液用磁力搅拌器充分搅拌，混匀2～4小时，在20℃过夜后过滤。并用分光光度计核查吸光度，阿辛蓝溶液的最大吸光度为662nm，派洛宁B溶液的最大吸光度为553nm。贮存液在20℃能保存3个月以上。
2.染色应用液
使用时，将2种贮存液按1∶1比例混合。应用液在20℃能保存2～4周。
【操作】 1.器材准备
使用前，先用流水，再用乙醇冲洗并干燥计数盘和盖玻片。将Fuchs-Rosenthal计数盘放在显微镜载物台上，加盖玻片。
Fuchs-Rosenthal计数池结构(图1-7-1) :分16大格;每大格体积为1mm (长)×1mm (宽)× 0.2mm (高) =0.2μl;每块计数盘有2个计数池，总体积=2×16×0.2μl =6.4μl。
2.尿标本染色
于试管中，将1份染色应用液和9份尿标本混匀，染色5分钟。
3.混匀混合液
将试管内染色尿标本颠倒混匀20～40次。
4.计数盘充液
用移液管吸取尿液，以45°角充入计数池中。充池量约15～16μl。充池后，静置5分钟。
图1-7-1 Fuchs-Rosenthal血细胞计数盘
5.显微镜计数
先用低倍镜( 10×10倍)扫描整个计数盘，保证颗粒分布均匀。然后，用高倍镜( 10×40倍)计数颗粒数量。大型颗粒(管型和鳞状上皮细胞)可在低倍镜下观察并计数。
计数原则:和血细胞计数相同，颗粒计数符合泊松分布的特征，为达到颗粒计数统计学精度，必须计算足够容积中的颗粒数。通常，管型和鳞状上皮细胞至少计数50个，使计数CV＜14%;白细胞和红细胞至少计数200个，使计数CV＜7%。为避免颗粒重复计数或漏计数，可采用“数左不数右，数上不数下”的规则。
6.结果报告
计数结果以“个/μl”报告。
【注意事项】 1.计数推荐方法
使用相差显微镜和活体染色技术。
2.尿标本
尿液有形成分检查参考方法采用不离心新鲜尿液标本。
3.器材
标本容器须使用塑料或硅化玻璃，避免颗粒黏附;容量为5～12ml。使用塑料或硅化玻璃移液管，避免尿中颗粒黏附，容量误差应＜5%;盖玻片须适用于在相差显微镜下观察，边角应呈圆形，边缘光滑。不能使用薄盖玻片(＜0.4mm)。盖玻片用25mm (长)×22mm (宽)，允许误差±1mm。盖玻片置于计数盘上如能见衍射光环，则表示平整。
4.充池要求
速度不能太快;凡充池液太多，计数区域充池不全、有气泡或有碎片等异常，均必须重新充池。
5.计数时间
应于1小时内完成计数;计数时如发现计数池液体干涸，须清洗后重新充池。
三、尿液有形成分检验的质量管理
(一)室内质控
尿液有形成分分析仪红细胞、白细胞计数检验项目，可参照GB/T 20468—2006《临床实验室定量测定室内质量控制指南》进行室内质控。应至少使用正常和异常2个浓度水平的质控品，每工作日至少检测1次，至少使用1 3s、2 2s失控规则。应制定程序对失控进行分析并采取相应的纠正措施，应检查失控对之前患者样品检测结果的影响。
(二)复检要求
当自动化尿液分析(包括尿干化学分析和尿液有形成分分析)结果异常时，需要做手工法尿沉渣显微镜检查复核。当自动化尿液分析结果阴性时，结合临床实际可不做显微镜复检。
如使用自动化尿液有形成分分析仪筛检尿液有形成分时，实验室应:
1.制定尿液有形成分分析的显微镜复检标准以实验室自定义(结合临床医师要求;临床特定疾病，如泌尿道疾病、肾病、糖尿病、应用免疫抑制剂等;理学和化学检查结果异常等情况)和尿液有形成分分析仪固有提示的异常为依据制定复检标准。
2.规定验证复检标准的标准和方法，假阴性率应＜5%。以显微镜检查结果作为真阳性和真阴性判断标准，各种仪器筛检结果与之比较，得出阳性符合率、阴性符合率、假阳性率和假阴性率数据。
3.记录和保存显微镜复检结果。
(三)镜检能力要求
镜检应能识别的尿液有形成分如下所述，能力考核时应采用至少50幅显微摄影照片(包括正常和异常尿液有形成分)或其他形式图像，要求能正确识别照片或图像中≥80%的有形成分。
尿液主要有形成分的形态特征如下:
1.上皮细胞 ( 1)鳞状上皮细胞:
直径30～50μm，扁平和圆形、多角形或卷曲呈管状;核圆形、居中，染色质中度致密;胞质大量、无色，伴角化颗粒。
( 2)肾小管上皮细胞:
直径15～35μm，多面体形或卵圆形;核圆形和偏位，染色质颗粒状;胞质含颗粒，无色。
( 3)移行上皮细胞:
直径20～40μm，多面体形或球形;核圆形或卵圆形，染色质细颗粒状;胞质无色、细颗粒状，可呈尾形。
2.血细胞 ( 1)红细胞:
正常红细胞直径7～8μm，呈圆形、近卵圆形双凹圆盘形，高渗标本呈锯齿形，边缘和表面不规则，低渗标本呈球形“影”细胞;胞质淡橘黄色，可无色，染色后呈红色或紫色。异型红细胞直径7～8μm，但不定，呈圆形或近卵圆形，泡状胞质;胞质淡橘黄色，可无色，染色后呈红色或紫色。
( 2)中性粒细胞:
直径10～12μm，呈圆形、卵圆形或阿米巴形;新鲜尿中核呈分叶状，陈旧尿中核模糊、呈卵圆形，染色质粗颗粒状聚集;新鲜尿中胞质颗粒状，陈旧尿中胞质无颗粒。
( 3)嗜酸性粒细胞:
直径大于中性粒细胞，呈圆形、卵圆形;核呈分叶状，染色质粗颗粒状;胞质含粗颗粒，Wright染色呈橘红色。
( 4)淋巴细胞:
直径7～10μm，呈圆形、卵圆形;核呈圆形、卵圆形或锯齿形，染色质致密;胞质透明。
( 5)单核细胞和巨噬细胞:
直径12～14μm，胞质含吞噬物质或多核者较大，呈圆形、卵圆形或不规则形;核呈分叶、锯齿、折叠状，巨噬细胞可多核，染色质细颗粒状;胞质呈泡沫状、空泡、含吞噬物质。
3.管型 ( 1)透明管型:
长形、雪茄形，有时扭曲或卷曲形，圆形末端或一端锥形，边缘光滑;长度不定，宽度常等于肾小管宽度，约为30～50μm;外观透明无色，折光性低，含少量颗粒;成分主要是Tamm-Horsfall黏蛋白和白蛋白。
( 2)颗粒管型:
长圆柱形，罕见折叠或弯曲，圆形末端，边缘光滑;长度不定，宽度常等于肾小管宽度，约25～50μm;外观可含少量或大量球形颗粒散布在基质上，颗粒大小各异，可细可粗;是透明基质散布各种大小颗粒。
( 3)红细胞管型:
圆柱状、雪茄形，圆形末端;长度不定，但常不长，宽度不定，可较宽;基质部分或全部覆盖完整或破碎红细胞。
( 4)白细胞管型:
形态和大小似红细胞管型，但基质部分或全部覆盖完整或破碎白细胞和大量颗粒。
( 5)细胞管型:
形态和大小似红细胞管型，但基质部分或全部覆盖完整或破碎肾小管上皮细胞，并常在管型中见到白细胞。
( 6)蜡样管型:
圆柱状，钝圆或方形末端;边缘有裂隙或锯齿;长度不定，但相对较短而粗硬，宽度不定，可较宽;是致密凝固蛋白质，是细胞凋亡的终末产物，牛油蜡样黄色基质，厚的胶样，高折光性。
( 7)宽管型:
形态似蜡样管型，常较宽，直径是肾小管宽度几倍，常＞40μm。
( 8)脂肪管型:
圆柱状、雪茄形、钝圆末端;长度不定，但常不长，宽度不定，可较宽;基质部分或全部覆盖各种大小的球形颗粒，高折光性，内部结构不易辨认，管型上常见肾小管上皮细胞。
4.微生物 ( 1)细菌:
单个微生物常1μm，可变;以2种形态为主，呈圆形或杆状;外观无色，Wright染色呈深蓝色;成堆或成链状，也可单个。
( 2)寄生虫:
可见蛲虫、阴道毛滴虫、埃及血吸虫卵等。
(3)真菌:
酵母菌约5～7μm，假菌丝长度可超过50μm;酵母菌形态呈卵圆形，假菌丝形态较长伴分支状，末端有出芽;外观无色和厚壁，显示出芽。
5.结晶 ( 1)无定形尿酸盐结晶:
细颗粒; pH＜5.8;双折光性;无色或红黄色、粉红色、棕红色和砖灰色。
( 2)无定形磷酸盐结晶:
微小颗粒; pH＞6.3;无色。
( 3)草酸钙结晶:
3～12μm;卵圆形、双锥体形; pH＜5.4;强双折光性;无色，偶见胆汁染色。
( 4)胆固醇结晶:
大;直角平板形，有一个或多个突起，呈层状; pH中性或酸性;中折光性;无色。
( 5)胱氨酸结晶:
大小不定;六边形，常部分层状; pH＜5.5;无折光性;无色。
( 6)三联磷酸盐结晶:
大小不定;呈六边形、星形、直角形; pH 6.2～7.0;中折光性;透明。
( 7)尿酸结晶:
中等大小;长菱形，偶见六角形，也可呈星形、圆筒形、立方形、玫瑰花形; pH ＜5.8;强折光性;多色，呈黄色、米黄色或棕黄色等。
6.其他 ( 1)污染物:
如纤维、淀粉颗粒、花粉和脂肪滴等。
( 2)黏液丝:
大小不定;常长条形，可卷曲;外观纤细透明、波浪形，SM染色呈粉红色或蓝色。
( 3)精子:
头4～6μm，尾40～60μm，可相互分离;头呈圆形或椭圆形，尾呈纤维丝状;胞质无色。